前沿概览 | 化学修饰在细胞外囊泡表面功能化中的应用

图1. 细胞外囊泡表面化学修饰方式示意图

细胞外囊泡膜表面存在着多种膜蛋白，如四跨膜蛋白（CD9,CD63,CD81）,Lamp2b及膜联蛋白等，这使其表面存在着大量可反应的功能化基团，如羧基（-COOH），氨基（-NH2）及巯基（-SH）等2。这些基团均可通过温和高效的反应方式同功能性修饰基团进行共价键合反应。

利用EDC/NHS偶联反应，可将羧基同氨基共价结合形成酰胺基团。此种反应方式针对伯氨基团及羧基进行无臂化键合，直接形成酰胺键，是蛋白质偶联反应中常用反应方式之一。Qi等使用表面带有羧基的直径为10 nm的超顺磁纳米粒子，利用EDC/NHS缩合偶联转铁蛋白分子至纳米粒子表面，形成带有转铁蛋白分子的超顺子纳米粒子3。之后将其同网织红细胞来源的细胞外囊泡进行共培养，利用细胞外囊泡表面带有的转铁蛋白受体，将超顺磁纳米粒子连接至细胞外囊泡表面，用于肿瘤诊断治疗。Zhang等通过巯基-马来酰亚胺加成反应，将整合素α3β1结合八肽cNGQGEQc共价结合至连接分子Maleimide-PEG2000-cholesterol一端，将cholesterol端插入到细胞外囊泡磷脂层中，从而将靶向肽结合到细胞外囊泡表面4。针对非小细胞肺癌细胞过表达整合素α3β1这一病理特性，靶向性递送包载有西贝素的细胞外囊泡至肿瘤组织进行抑癌治疗。

利用膜表面蛋白质分子中的氨基及羧基残基进行化学反应除以上偶联反应外，还有一大类为生物正交反应。相比于传统的偶联反应，生物正交反应效率及选择性更高，且毒副作用较小，反应条件更为温和，特别是无Cu催化的点击化学偶联方式更为蛋白质分子表面修饰提供了更温和高效的反应途径。生物正交反应指能够在活体细胞或组织中，在不干扰生物自身生化反应条件下可进行的化学反应5。在生物正交反应中，点击化学（click chemistry）因其易于操作，较高的反应特异性及反应效率，副反应较少及较低的生物毒性，成为化学修饰改性的重要手段。通过点击化学反应不仅可以对膜蛋白分子的功能基团进行修饰改性，还能将多种标记分子（如荧光探针，辐射标记物等）连接到靶点细胞以便于后续追踪治疗。

经典的点击化学反应是通过Cu(I)催化叠氮化物-炔烃的环加成反应。Anchordoquy等首先利用EDC/NHS偶联反应将含炔基的4-戊烯酸同细胞外囊泡膜表面氨基结合，形成带有炔基的细胞外囊泡。之后，在铜催化下，将带有叠氮基团的荧光分子Azide-Fluor 545通过点击化学反应方式标记至细胞外囊泡表面（图2）。通过此种此种方式修饰细胞外囊泡，并未对其尺寸、结构及功能等产生影响，表明这是一种温和高效的表面修饰手段。点击化学反应相比于传统偶联反应有着诸多优势，合成步骤简单，反应效率高且耗时较少，相比于复杂的生物工程改造费用更为低廉。最重要的是，在生物大分子中不存在非芳香环类双键，通过点击化学反应可避免多种错误位点修饰导致的副反应，减少对生命体功能性影响。但铜催化的点击化学反应仍存在一定缺陷，主要是由于铜盐的存在所导致的细胞毒性及神经系统损伤，并且增加了后续分离纯化的难度。基于这一现状，无铜催化点击化学应运而生，用于克服以上问题。

图2. 通过叠氮-炔基点击反应将荧光分子Azide-Fluor 545结合至细胞外囊泡表面。

无Cu催化的点击化学反应主要为带有环辛炔基团化合物同叠氮化物发生环加成形成三唑环结构的反应过程7。此种反应过程无需加入Cu (I)催化剂，反应条件温和，反应特异性及反应活性较高，且副反应较少。较为常用的环辛炔基团化合物为二苄基环辛炔 (DBCO)，其对叠氮化物具有出色的反应活性及较高的反应特异性，并且具有良好的生物相容性，广泛应用于生物功能化修饰。

Gao等通过两步修饰将环状多肽接枝到细胞外囊泡表面8。选用连接分子DBCO-Sulfo-NHS酯，将NHS酯端其同细胞外囊泡表面膜蛋白的氨基进行结合，之后将带有叠氮基团的多肽分子同表面带有DBCO的细胞外囊泡进行反应，从而形成外表面修饰有环状多肽的细胞外囊泡。通过共培养及梯度离心等处理过程将抗炎药物姜黄素包裹入细胞外囊泡中，利用环状多肽靶向缺血性组织细胞表面整合素特性，用于治疗缺血性脑中风。Khuloud等为考察胰腺癌细胞对不同供体细胞来源的细胞外囊泡的摄取差异，选取连接分子DBCO-NHS，将带有叠氮基团的荧光分子Alexa fluor@ 488 azide标记到细胞外囊泡表面，从而定量考察胰腺癌细胞对各种细胞外囊泡的摄取情况，并利用荷瘤小鼠模型考察了胰腺癌小鼠对不同来源细胞外囊泡体内生物分布情况的差异，为后续选择适合的细胞外囊泡用于治疗胰腺癌提供了参考依据（图3）。

图3. 利用DBCO-NHS制备荧光标记细胞外囊泡示意。

图4. 基于点击化学反应开发的EV Click Chip系统示意图。

图5. 靶向细胞外囊泡mRNA疫苗制备及给药免疫示意图。

类似于DSPE等磷脂结构分子，固醇类分子也因其可同磷脂膜层发生疏水相互作用而插入细胞外囊泡膜内，被用于锚定功能分子至细胞外囊泡膜表面。Ye等将表面带有胆固醇分子的磁珠用于捕获血清中的细胞外囊泡，之后选用适配体修饰的CuO纳米粒子同捕获后的细胞外囊泡共混，在酸性条件下，CuO氧化为Cu2+离子，在抗坏血酸钠还原作用及聚（胸腺嘧啶）配体作用下，再次形成CuNPs，由于体系中荧光强度同CuNPs浓度呈正相关，由此对细胞外囊泡进行定量检测15。利用疏水相互作用将类磷脂结构分子及固醇类分子插入到细胞外囊泡膜表面具有易于操作，无化学反应试剂，反应条件温和等优势，但同时存在着反应特异性差，反应效率相对较低，结合作用稳定性较差等问题。

近年发现部分多肽具有同膜蛋白分子特定区域的识别结合作用，从而可特异性识别并绑定修饰基团至膜表面。这一发现可改善非共价键膜结合方式特异性较差的问题。Yin等通过噬菌体筛选方式发现了多肽CP05同细胞外囊泡膜蛋白CD63第二细胞外环能够发生特异性结合16。利用多肽-蛋白相互作用方式，可将肌肉靶向多肽M12及PMO同CP05结合并锚定到细胞外囊泡表面，形成可靶向肌肉组织并递送PMO的功能化细胞外囊泡。Wang等通过3D打印技术制备了PCL支架，并将CP05接枝到支架表面用于固定细胞外囊泡，通过电穿孔方式将VEGF plasmids载入到细胞外囊泡中，将此种支架用于大段骨缺损的成骨诱导及血管重塑17。

现有研究表明，细胞外囊泡膜表面功能化修饰可通过多种方式达成，其中化学修饰方式具有可控性高，结构选择性多样化，制备方式简便等优势。需要注意的是，无论是共价键还是非共价键结合方式都存在着一定弊端，特别是对细胞外囊泡膜表面功能位点的影响，会因修饰而导致其结构完整性被破坏，因此，应依据应用场景及改造目的选取合适的修饰方式，或结合不同修饰方式用以达到最佳修饰效率。同时，冻融，超声，挤压及共孵育等物理方式也可同前述的各种化学方式进行结合使用，从而提高修饰效率，提高细胞外囊泡靶向性能及载药能力。

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